2.5 冷激蛋白的水产结构分析

为更好了解冷激蛋白潜在的生物功能，分析其蛋白的品腐空间结构。将水产品腐败希瓦氏菌冷激蛋白的败希白氨基酸序列提交到PSＩPRED预测其二级结构，结果见图4。瓦氏典型的菌冷激蛋结构冷激蛋白的二级结构包含5个β折叠，预测得到的分析二级结构与这个结果大致相符，Csp1589和Csp1376二级结构的水产最后一个β折叠出现断层，这可能是品腐天冬酰胺预测可信度太低所致。

将冷激蛋白的败希白氨基酸序列提交SWＩSS-MODEL网站，根据序列相似性及模型质量分别选取1mjc的瓦氏A链、5xv9的菌冷激蛋结构A链、3i2z的分析B链作为Csp1589、Csp1376和Csp2252的水产模板建模。然后，品腐用PROCHECK和verify3D对所建三级模型进行质量评估。败希白构建的腐败希瓦氏菌冷激蛋白三级结构都包含5个反向平行的β链，其形成了一个桶状结构，符合冷激蛋白的已知特征。由拉氏构象图可看出，对于Csp1589蛋白模型，氨基酸处于有利区域、额外允许区域、一般允许区域以及不允许区域的量分别为88.9%，11.1%，0%和0%。对于Csp1376型蛋白模型，对应值分别为92.7%，7.3%，0.0%和0.0%。对于Csp2252型蛋白模型，对应值分别为96.1%，3.9%，0.0%和0.0%，氨基酸全部处于有利区域和额外允许区域，模型质量较好。在Ｖerify3D结果中，对于Csp1589、Csp1376和Csp2252模型，平均分≥0.2的氨基酸的量分别是和100%，89.86%和100%，平均分≥0.2的氨基酸的量达到80%就认为蛋白三级模型是合格的，因此，以verify3D结果来看，这3个模型均具有较好的质量。

2.6 冷激蛋白的互作蛋白及配体结合位点分析

利用STRＩNG和COACH网站对腐败希瓦氏菌冷激蛋白进行分析，得到如图6所示与其紧密作用的蛋白质和潜在的配体结合位点。对于腐败希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589、Csp1376和Csp2252，STRＩNG分别检测到5，4，10个与其相互作用的蛋白（图6）。与冷激蛋白Csp1589存在相互作用的蛋白是组氨酸激酶（ABP76854.1）、甲基转移酶（ABP75296.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、伴侣蛋白（htpG）。与冷激蛋白Csp1376存在相互作用的蛋白是组氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、伴侣蛋白（htpG）。与冷激蛋白Csp2252存在相互作用的蛋白是依赖ATP的Clp蛋白酶（ABP75948.1）、依赖ATP的Clp蛋白酶适配蛋白（ClpS）、组氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、组氨酸磷酸氨基转移酶（hisC）、磷酸庚糖异构酶（gmhA）、含有CBS结构域的蛋白（ABP76571.1）、氮调控蛋白PtsN（ABP74443.1）、伴侣蛋白（htpG）。其中组氨酸激酶是一个磷酸化组氨酸保守残基的信号传导酶家族，参与构成双组分信号传导系统。双组分信号传导系统可以感应环境变化，应对环境变化引起的负面效应，研究表明一些双组分信号转导系统参与了细菌的低温适应过程，推测腐败希瓦氏菌冷激蛋白与细胞对逆境的适应有关。DNA聚合酶是DNA复制的重要酶，冷激蛋白可能与DNA复制有关。冷激蛋白作为一种伴侣蛋白，可能与伴侣蛋白htpG存在竞争关系。从分析结果可推测相较Csp1589和Csp1376，腐败希瓦氏菌冷激蛋白Csp2252的功能可能更为复杂。在许多重要的生命活动中，蛋白质功能的执行依赖于蛋白质与配体的相互作用，对于蛋白质配体结合位点的预测具有重要的意义。例如：把小分子放到目的蛋白的配体结合位点，优化配体构象和位置，使之和目的蛋白有最佳的结合作用，就有可能发现抑制该蛋白的化合物。对于腐败希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589、Csp1376和Csp2252，其分别预测到2，2，1个可能性较高的配体结合位点（图6）。

3 结论

冷激蛋白是解析细菌低温适应的关键蛋白之一。本研究成功扩增了水产品腐败希瓦氏菌的3个冷激蛋白基因，并对其进行生物信息学分析，获得蛋白理化性质、结构和功能方面的相关进展。腐败希瓦氏菌冷激蛋白均为亲水的小分子酸性蛋白质，皆位于细胞质，为非分泌型、非跨膜蛋白，都存在冷激蛋白特有的冷休克结构域，存在DNA结合位点和RNA结合基序（motif），能与单链DNA和单链RNA结合。腐败希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589和Csp1376与大肠杆菌冷激蛋白CspA亲缘关系较近，可能在腐败希瓦氏菌低温适应过程中起重要作用。冷激蛋白的二级结构和三级结构均符合冷激蛋白家族的特征，其可靠的三级模型可用于各种对接和药物靶向研究。通过蛋白互作和配体结合位点的分析，对其功能有更深的了解，为后续验证冷激蛋白在腐败希瓦氏菌低温适应过程中的功能，以及水产品中腐败希瓦氏菌冷激蛋白抑制剂的筛选奠定基础。

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